ещё
свернуть
Все статьи номера
статья 2 из 7
Не прочитано
9
Август 2016года
Практикум специалиста

Влияние преаналитического этапа на результаты исследования цитокинового профиля отделяемого цервикального канала у женщин с эктопией шейки матки

В статье представлена зависимость результатов исследования уровня цитокинов и хемокинов в цервикальной слизи от метода забора отделяемого цервикального канала по данным разных авторов. Описан преаналитический этап забора содержимого цервикального канала, обеспечивающий получение достоверных данных об уровне цитокинов. Проведен расчет диагностического значения результатов исследования уровня провоспалительных цитокинов в цервикальном содержимом у пациенток с эктопией шейки матки.

Н.Б. Захарова, д-р мед. наук, проф., заведующая Центральной научно-исследовательской лабораторией
Н.Ф. Хворостухина, канд. мед. наук, доцент, заведующая кафедрой акушерства и гинекологии педиатрического факультета
Ю.В. Михеева, врач клинической лабораторной диагностики ГУЗ «Областной онкологический диспансер № 2», аспирант кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета
ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России,

За последние несколько лет исследование состава содержимого цервикального канала позволило установить роль цитокинов в развитии механизмов противоинфекционной резистентности генитального тракта и диагностике воспаления у больных с различной патологией шейки матки [1, 4, 21, 24, 25].

Исследование цитокинового состава цервикального отделяемого позволяет оценить противоинфекционную и противоопухолевую резистентность локального иммунного ответа генитального тракта [5, 20].

Изучение иммунологических параметров местного иммунитета позволяет оптимизировать лабораторно-диагностический комплекс исследований, способствующий повышению эффективности этиопатогенетической терапии патологии шейки матки и решению вопросов стандартизации назначения иммуномодулирующих средств. Что наиболее важно, это дает возможность проводить максимально индивидуализированное лечение больных.

Хроническое воспаление, чрезмерная пролиферация и злокачественная трансформация клеток эпителия тесно сопряжены с дисбалансом локального иммунного ответа [12, 14]. Слизистая оболочка шейки матки постоянно подвергается воздействию повреждающих факторов. Особенно агрессивным антигенным воздействием обладает патогенная и условно-патогенная флора [17]. Постоянная активация локального цервикального иммунитета становится следствием усиления синтеза провоспалительных цитокинов клетками иммунной системы, которые проникают в очаг хронического воспаления (мононуклеарные фагоциты, естественные киллеры, Т-хелперы) [8, 11, 15, 23]. В цервикальном канале из-за лимфоидной гистиоцитарной инфильтрации с примесью плазмоцитов, нейтрофилов, гранулоцитов, усиления полнокровия сосудов происходит увеличение секреции слизи с отторгшимися дистрофически измененными клетками эпителия и воспалительным детритом, которые изменяют выделение медиаторов воспалительного процесса. Это становится причиной развития эпителиальной неоплазии и рака шейки матки [20, 25].

Несмотря на большое число опубликованных работ, посвященных изучению состава цитокинов при заболеваниях шейки матки, до сих пор нет общепринятого метода забора и последующей обработки образцов отделяемого цервикального канала для проведения количественного анализа цитокинов. В связи с этим результаты исследования уровня цитокинов в отделяемом цервикального канала (несмотря на применение наборов реагентов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с одинаковым диапазоном величин определяемых показателей) у разных авторов значительно различаются.

Анализ использованных авторами методов исследования цитокинов показал, что наибольшее значение имеет СПОСОБ забора отделяемого цервикального канала. Самые низкие показатели уровня цитокинов дают авторы [4, 8], которые производили забор отделяемого цервикального канала ложкой Фолькмана или пинцетом на глубине не менее 2 см от экзоцервикса. Разведение в физиологическом растворе 1:1. Для определения цитокинов были использованы наборы реагентов ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Авторы, у которых представлены самые высокие показатели, выполняли забор слизи из цервикального канала универсальным зондом и помещали в пробирку типа Эппендорф с 1 мл буфера, содержащего 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 10 мМ трис-гидроксиметиламинометана, 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,5 мМ ингибитора протеиназ (PMSF) в 100 мл дистиллированной воды, рН 7,4. Затем проводили экстракцию встряхиванием на вортексе в течение 1 мин. Смесь центрифугировали в течение 5 мин при 900 g и отбирали надосадочную жидкость, которую немедленно замораживали и хранили до анализа при минус 80 ºС. В слизи цервикального канала определяли содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов методом ИФА (ELISA). Для проведения анализа использовали наборы фирмы ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Для получения средних значений (среднее значение в диапазоне определяемых концентраций показателя, представленное в инструкции к набору) авторы применяли забор цервикального отделяемого урогенитальным зондом и помещали биоматериал в пробирку с физиологическим раствором в концентрации 0,155 М, что позволяло получить разведение цервикальной слизи 1:200. Образцы тестировали методом ИФА. Определение количественного содержания цитокинов в образцах осуществляли с использованием набора реагентов фирмы «Вектор-Бест». То есть преаналитический этап имеет большое значение для исследования уровня цитокинов в секрете шейки матки в диапазоне определяемых уровней показателей в биологических жидкостях: ИЛ-8 — от 0 до 250 пг/мл, ИЛ-6 — от 0 до 300 пг/мл, ИЛ-1β — от 0 до 250 пг/мл [9, 10, 15, 18].

Метод забора цервикального отделяемого для исследования содержания цитокинов с использованием наборов реагентов ЗАО «Вектор Бест»

Предварительные исследования показали, что наибольшее значение для получения достоверных данных об уровне цитокинов отделяемого цервикального канала имеет преаналитический этап. В него были включены следующие процедуры:

  • удаление лишних выделений;
  • обработка влагалищной части шейки матки и стенок влагалища стерильным физиологическим раствором;
  • забор отделяемого цервикального канала урогенитальным зондом;
  • получение разведения цервикальной слизи в 200 раз в 0,155 М растворе хлорида натрия.

Чтобы удалить лишние выделения, подлежащую исследованию область осторожно очищали от влагалищных выделений стерильным ватным тампоном.

Обработку влагалищной части шейки матки и стенок влагалища проводили путем орошения стерильным физиологическим раствором для исключения попадания выделений в момент забора материала для исследования.

Для забора цервикальной слизи использовали стерильный мягкий урогенитальный зонд, который вводили в цервикальный канал на глубину не менее 2 см, дважды повернув его сначала в одну сторону, затем в другую. Для стандартизации объема получаемого содержимого цервикального канала проводили аналитическое взвешивание 30 образцов урогенитальных зондов. Установлено, что после полного пропитывания зонда количество получаемой слизи цервикального канала составляет 5 ± 0,05 мг.

Пропитанный слизью эндоцервикса урогенитальный зонд переносили в пробирку типа Эппендорф, содержащую 1000 мкл 0,155 М раствора хлорида натрия, встряхивали ее с помощью центрифуги-вортекса СМ 70М-07 в течение 10 мин и получали разведение отделяемого цервикального канала 1:200. Полученные образцы замораживали при минус 40 °С и хранили до проведения анализа.

Были обследованы 49 пациенток в возрасте от 20 до 40 лет, в т. ч. 18 женщин с рецидивом эктопии шейки матки, 21 женщина с впервые выявленной эктопией шейки матки, 10 практически здоровых женщин без патологических изменений тканей шейки матки (контрольная группа).

Полученные данные анализировали с помощью стандартных методов статистической обработки с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel и пакета прикладных программ для научно-технических расчетов Statistica v6.0, Microsoft Office Excel 2007. Статистическую обработку данных проводили методами непараметрической статистики: в качестве критерия достоверности отличия между двумя независимыми группами использовался непараметрический критерий (U) Манна — Уитни и тест Вилкоксона. Данные представлены как медиана и интерквартильный размах для непараметрических переменных. При оценке диагностических характеристик исследуемого маркера применялся анализ кривой ROC, предусматривающий сравнение операционных характеристик теста — чувствительности и специфичности. В качестве нулевой гипотезы принималось, что площадь под кривой ROC не отличается от величины 0,5. Пороговые уровни биомаркера определялись при построении графиков зависимости чувствительности и специфичности от концентрации биомаркера в отделяемом шейки матки.

Анализ полученных данных показал, что у пациенток как с впервые выявленной эктопией шейки матки, так и с рецидивирующим течением заболевания в цервикальном содержимом определяются высокие уровни всей группы провоспалительных цитокинов (таблица).

Таблица
Уровень цитокинов в отделяемом цервикального канала у обследованных женщин
Группа обследованныхМедиана концентрации цитокинов, пг/мл (25–75 процентиль)
ИЛ-1β, нг/млИЛ-6, нг/млИЛ-8, нг/млИЛ-10, нг/мл
Контрольная группа8,3* (2,6; 22,2)15,6* (4,7; 43,3)102,9* (21,7; 173,3)7,1 (3,2; 9,9)
Женщины с рецидивирующим течением эктопии шейки матки104,6* (26,8; 378,4)327,5* (139,5; 484,9)312,8* (287,5; 329,4)11,7* (7,0; 22,0)
Женщины с впервые выявленной эктопией шейки матки102,4* (25,8; 418,8)428,1* (106,4; 953,1)281,0* (150,9; 325,2)9,0 (2,4; 15,7)
* Р ≤ 0,05 по сравнению с контрольной группой.

Уровень провоспалительного цитокина ИЛ-1β у пациенток с впервые выявленной эктопией шейки матки и пациенток с рецидивирующим течением заболевания выше в 12 раз по сравнению с величинами в контрольной группе.

Содержание ИЛ-6 у пациенток с рецидивирующим течением эктопии шейки матки выше в 20 раз по сравнению с группой здоровых женщин, а в группе с впервые выявленной эктопией шейки матки — в 27 раз. Это объясняется одной из основных функций ИЛ-6, который регулирует процессы созревания антител, продукцию В-лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов. ИЛ-6 участвует в остром воспалительном процессе у пациенток с патологией шейки матки.

Показатель ИЛ-8 в обеих группах больных женщин выше, чем у здоровых, в 2,5–3 раза, что свидетельствует об активации полиморфно-ядерных лейкоцитов (нейтрофилов) стромы шейки матки в ответ на экзогенную стимуляцию компонентами бактериальной стенки. ИЛ-8 является мощным хемокином, который обеспечивает хемотаксис Т-клеток, нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов в очаг воспаления. Высокое содержание ИЛ-8 у пациенток контрольной группы объясняется наличием во влагалище здоровых женщин условно-патогенной флоры, которая вступает во взаимосвязь с местной иммунной системой.

Уровень ИЛ-10 у женщин с эктопией шейки матки в каждой из обследованных групп выше, чем у здоровых, в 1,2–1,6 раза. Это может свидетельствовать о реализации механизма «уклонения» инфекционных патогенов от иммунного ответа, опосредованного в первую очередь фагоцитами.

Анализ ROC-кривых и расчет пороговых значений показал, что подъем содержания в цервикальном содержимом ИЛ-1β до 62,4 нг/мл, ИЛ-6 до 437,7 нг/мл, ИЛ-8 до 310,7 нг/мл (чувствительность 88,9%, 88,9, 72,2%; специфичность 62,4%, 67,6, 76,2% соответственно) подтверждает наличие локального острого воспалительного процесса и названные биомаркеры могут быть использованы для подтверждения наличия локального острого воспалительного процесса. У ИЛ-10 в отделяемом шейки матки значения площади под кривой ROC достоверно не отличаются от 0,5, т. е. этот маркер не имеет диагностической значимости у обследованных пациенток.

Высокие уровни провоспалительных цитокинов в цервикальном отделяемом показывают перспективность исследования основных провоспалительных цитокинов как индикаторов локального воспаления в ткани шейки матки, с включением в него эпителиальной выстилки. При этом колебание величин трех провоспалительных цитокинов отделяемого цервикального канала в диапазоне концентраций ИЛ-1β от 30,6 до 62,4 нг/мл, ИЛ-6 от 74,8 до 437,7 нг/мл, ИЛ-8 от 189,2 до 310,7 нг/мл демонстрирует индивидуальный характер обнаруживаемых изменений.

Предложенная стандартизация преаналитического этапа получения цервикального отделяемого позволяет осуществить индивидуальный контроль активности воспалительных изменений в тканях шейки матки с эктопией при текущем наблюдении женщин, целесообразна для выявления хронизации воспалительного процесса, при определении мишени для индивидуальной патогенетически обоснованной терапии и оценке ее эффективности.

Список использованной литературы

1. Абрамовских О.С., Телешева Л.Ф., Летяева О.И. и др. Иммунологические аспекты патогенеза папилломавирусной инфекции репродуктивного тракта женщин // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012. № 2. С. 95–101.

2. Ахматова А.Н. Клинико-иммунологические критерии прогноза персистенции вируса папилломы человека у женщин с хроническим цервицитом: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.01; 14.03.09. Челябинск, 2010. 23 с.

3. Гизингер О.А. Система провоспалительных цитокинов у женщин с урогенитальным трихомонозом // Медицинская иммунология. 2005. № 5–6. С. 601–604.

4. Гизингер О.А., Летяева О.И., Зиганшин О.Р., Семенова И.В. Иммунобиологические дисфункции при осложненной хламидийной инфекции и методы их локальной иммунокоррекции // Репродуктивное здоровье. Восточная Европа. 2012. № 2 (20). С. 141–151.

5. Грибова С.Н. Усовершенствование диагностики и лечения хронического неспецифического цервицита у женщин репродуктивного возраста: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.01. Волгоград, 2010. 24 с.

6. Зайцева Г.А., Вершинина О.А., Матрохина О.И. и др. Цитокиновый статус доноров крови и ее компонентов // Фундаментальные исследования. 2011. № 3. С. 61–65.

7. Зотова М.А. Иммунологические и молекулярно-биологические факторы персистирующего течения папилломавирусной инфекции: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 14.03.09. Челябинск, 2011. 27 с.

8. Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. Персистирующая папилломавирусная инфекция: цитокиновый дисбаланс и подходы к терапии // Эффективная фармакотерапия. Акушерство и гинекология. 2013. № 2 (18). С. 54–60.

9. Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения концентрации человеческого интерлейкина-1 бета. ЗАО «Вектор-Бест». Новосибирск. 15.10.08. 23 с.

10. Инструкция по применению набора реагентов для количественного определения человеческого интерлейкина-6 (ИЛ-6) в биологических жидкостях человека и культуральных средах. ЗАО «Вектор-Бест». Новосибирск. 20.05.08. 23 с.

11. Карапетян Т.Э., Кречетова Л.В., Зиганшина М.М., Ванько Л.В. Содержание цитокинов в отделяемом цервикального канала у беременных с бактериальным вагинозом // Акушерство и гинекология. 2011. № 5. С. 39–44.

12. Коган Е.А. Межклеточные взаимодействия при опухолевом росте // Межклеточные взаимодействия / Под ред. М.А. Пальцева, А.А. Иванова. М., 1995. С. 127–189.

13. Мураков С.В. Оптимизация лечения рецидивирующего хламидийного цервицита на фоне деформации шейки матки: Автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.01. М., 2009. 26 с.

14. Притулина Ю.Г., Криворучко И.В., Шенцова В.В. и др. Анализ цитокинового статуса при ряде инфекционных заболеваний // Успехи современного естествознания. Медицинские науки. 2014. № 2. С. 16–20.

15. Середа Н.Б., Маркелова Е.В., Спорыхина Т.Д. и др. Патогенетическая роль вируса папилломы человека в патологии шейки матки // Российский аллергологический журнал. 2010. № 1. С. 160–162.

16. Симбирцев А.С., Тотолян А.А. Цитокины в лабораторной диагностике // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2015. № 2. С. 82–98.

17. Тирская Ю.И., Рудакова Е.Б., Шакина И.А., Цыганкова О.Ю. Роль цервицитов в акушерско-гинекологической патологии // Лечащий врач. 2009. № 10. С. 63–66.

18. Точиева М.Х. Цитокиновый статус женщин с невынашиванием беременности при наличии генитального кандидоза: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.01; 14.00.36. М., 2007. 26 с.

19. Шехтер М.С. Роль артериальной эмболизации при раке шейки матки, осложненном кровотечением: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.01. Волгоград, 2008. 24 с.

20. Щербина Н.А., Госеев Д.А. Новые пути оптимизации ведения больных с эктопией шейки матки с учетом некоторых иммунологических особенностей // Научные ведомости. Серия «Медицина. Фармация». 2014. № 11 (182). С. 102–104.

21. Щетинина Т.А. Значение бальнеологического средства «Эльтон» в комплексном противовоспалительном лечении острых и хронических воспалительных заболеваний шейки матки и влагалища: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.01. 2008. 25 с.

22. Campos A.C., Murta E.F., Michelin M.A. et al. Evaluation of cytokines in endocervical secretion and vaginal pH from women with bacterial vaginosis or human papillomavirus // ISRN Obstet. Gynecol. 2012. Vol. 2012. Article ID 342075. 7 pages. doi:10.5402/2012/342075.

23. Kellar K.L., Douglass J.P. Multiplexed microsphere-based flow cytometric immunoassays for human cytokines // J. Immunol. Meth. 2003. Vol. 279. P. 277–285.

24. Ning Y.M., Wang Y., Lü L. et al. Pathogenesis and clinical significance of interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha in cervicitis // Zhonghua. Yi. Xue. Za. Zhi. 2009. Vol. 89 (24). P. 1684–1686.

25. Singh R., Kumar A., Creery W.D. et al. Dysregulated expression of IFN γ and IL 10 and impaired IFN γ mediated responses at different disease stages in patients with genital herpes simplex virus 2 infection // Clin. Exp. Immunol. 2003. Vol. 133. № 1. Р. 97–107.

Изменить парадигму здравоохранения
№ 9, 2016
Дополнительные критерии оценки степени тяжести воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин