ещё
свернуть
Все статьи номера
статья 7 из 7
Не прочитано
9
Август 2016года
Повышение квалификации

Реформирование практики бактериологических исследований: новый уровень микробиологической диагностики

В статье представлен путь пошагового развития лаборатории клинической микробиологии: техническое перевооружение «ручных» операционных процедур на разных этапах исследований, внедрение принципов стандартизации технологического процесса и оценки результатов, освоение инновационных экспресс-методов этиологической диагностики. Подчеркнута необходимость руководствоваться новыми научными взглядами на проблему антибиотикорезистентности микроорганизмов для обеспечения достоверности результатов микробиологических исследований. Представлен анализ наиболее интересных результатов микробиологических исследований при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, урогенитального тракта и мочевыводящих путей.

Ю.И. Тарасов, д-р мед. наук, действительный член Российской академии медико-технических наук, проф., главный врач
С.Ю. Усачева, канд. мед. наук, ст. науч. сотр., врач-бактериолог – заведующая бактериологической лабораторией
Е.А. Мозжухина, врач-бактериолог
ГБУЗ Нижегородской области «Клинический диагностический центр»,

Роль и значение микробиологических исследований в практике здравоохранения трудно переоценить ввиду их особой актуальности для этиологической диагностики инфекционных заболеваний и большой социальной значимости для оценки опасности их распространения среди населения. Хорошо известно, какой серьезной проблемой является антибиотикорезистентность микроорганизмов. Угроза распространения мультирезистентных штаммов носит глобальный характер. Ситуация с каждым годом становится все драматичнее из-за того, что антибиотикорезистентные вирулентные штаммы, формирующиеся обычно в госпитальной среде, теперь широко циркулируют во внебольничных условиях.

Микробиологические исследования входят в стандарты обследования больных с инфекционными заболеваниями различных нозологических форм с целью уточнения этиологического диагноза и определения тактики целенаправленных лечебных и профилактических мероприятий. Результаты микробиологических анализов являются основой мониторинга и прогноза эпидемиологической ситуации в конкретном регионе и в целом по стране. Данные о структуре резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций используются в медицинской практике при эмпирическом назначении антибиотиков, а также для формирования больничных формуляров.

Более трех с половиной веков, начиная с открытия А. ван Левенгуком мира микробов, микробиология как наука развивалась интенсивно, а порой революционно. В то же время в России микробиологическая практика долгие десятилетия пребывала в неизменном состоянии. До настоящего дня большинство бактериологических лабораторий располагают минимально необходимым набором оборудования и технических средств. Микробиологические технологии остаются трудоемкими и подчас нестандартизованными. Методы работы с изолятами микроорганизмов, разработанные еще в XIX в. Робертом Кохом и его последователями, используются до настоящего времени почти в неизменном виде [13]. Чашки Петри с питательными средами, бактериологические петли и некоторые другие специальные инструменты являются визитной карточкой большинства микробиологических лабораторий в отечественном здравоохранении.

Несмотря на стремительное развитие, начиная с 1970–1980-х гг., современных методов индикации микроорганизмов на основе молекулярно-генетических, иммунологических, хроматографических исследований, в широкую бактериологическую практику в системе государственного здравоохранения, к большому сожалению, эти методы до настоящего времени не вошли.

Прерогативой деятельности бактериологических лабораторий в ЛПУ является совершенствование классической культуральной диагностики. Традиционное микробиологическое исследование биологического материала остается по праву золотым стандартом этиологической диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний, поскольку позволяет изучить биологическую активность возбудителей, оценить массивность микробного очага, определить чувствительность к антибактериальным препаратам и специфическим лечебным бактериофагам.

Современное здравоохранение ставит перед клинической микробиологией задачу выбора адекватной тактики антибиотикотерапии, при условии максимально быстрого ее назначения. Это диктует высокие требования к качеству лабораторных результатов. Решение столь актуальной проблемы лежит в плоскости стандартизации и автоматизации на всех этапах микробиологических исследований, что позволит исключить субъективные факторы, сократить время получения результата, снизить трудозатраты, получить корректные результаты [3, 10].

Значительный прогресс в клинической микробиологии наметился в конце 1990‑х гг., когда на российском рынке начали появляться качественные сертифицированные расходные материалы, многочисленные приборы для осуществления всех операционных процедур на этапе пробоподготовки и культивирования микроорганизмов, автоматические и полуавтоматические анализаторы для биохимической идентификации широкого спектра возбудителей и определения их антибиотикочувствительности, автоматические системы для получения гемокультуры. Однако желанная автоматизация микробиологических технологий оказалась доступной лишь незначительному числу крупных лабораторий. Причина заключается в высокой стоимости оборудования и, что еще более важно, готовых сред и наборов реагентов. К тому же многие анализаторы относятся к оборудованию закрытого типа и заменить расходные средства производителя на другие невозможно. Понятно, что эксплуатация анализаторов вместе с большими преимуществами влечет значительное удорожание исследований.

Реформирование бактериологических исследований

Нижегородский областной клинический диагностический центр не остался в стороне от прогрессивных течений в отечественном здравоохранении, и на протяжении последних 17 лет в лаборатории клинической микробиологии идет непрерывный процесс, направленный на стандартизацию исследований, внедрение современных методов и технологий, позволяющих, насколько возможно, перейти от ручной, трудоемкой лабораторной практики к рациональной логистике операционных процедур и новому дизайну исследовательской работы [11].

Реформирование бактериологических исследований происходило пошагово, в плановом порядке, с учетом финансовых возможностей бюджетного учреждения. На начальном этапе в качестве приоритетных были поставлены следующие задачи:

  • переоснащение всех звеньев микробиологических исследований сертифицированными средствами отечественного и зарубежного производства;
  • обновление рутинного базового оборудования и приобретение оборудования, обеспечивающего малую автоматизацию технологического процесса (пипеточные дозаторы, вортексы, электронные весы, денситометры, диспенсоры, анаэростаты и т. д.), микроскопов с современной оптической системой.

Все микробиологические исследования проводятся в соответствии со стандартами, разработанными на основе последних официальных руководств [4, 5].

В целях полноценной этиологической диагностики различных заболеваний, в комплексе с культуральным анализом выполняются микроскопические исследования, определение специфических антител и инновационные диагностические экспресс-тесты. В лаборатории реализуется многоступенчатая система контроля качества.

Знаменательным этапом совершенствования микробиологических исследований явилось внедрение в практику метода масс-спектрометрии. Ввод в эксплуатацию в 2012 г. высокотехнологичного оборудования последнего поколения — масс-спектрометра — открыл новую эру в лабораторной диагностике и позволил решить ключевые задачи: сократить сроки проведения анализов до 2–5 сут (вместо 4–7 сут и более, в зависимости от вида исследования), обеспечить практически 100% специфичность идентификации микроорганизмов и при этом значительно расширить границы возможностей общепринятых методов определения таксономической принадлежности выделенных микроорганизмов.

Конечной целью микробиологической диагностики является определение чувствительности этиологически значимых микроорганизмов, выделенных из биологического материала, к антибактериальным препаратам. Изучение чувствительности микробных агентов к антибиотикам позволяет выбрать тактику этиотропной терапии у конкретных пациентов и прогнозировать эффективность лечения при инфекционно-воспалительных заболеваниях.

Анализ данных, полученных в ходе рутинных исследований, позволяет оценить распространенность резистентности микроорганизмов к различным антибактериальным препаратам в отдельных стационарах и в конкретных регионах.

Для изучения антибиотикорезистентности в практике нашей лаборатории используется наиболее распространенный диско-диффузионный метод Керби — Бауэра. До 2014 г. оценка антибиотикограммы и интерпретация результатов осуществлялась в свете рекомендаций Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США, что документально регламентировалось МУК 4.2.1890-04 [6]. В настоящее время наиболее обоснованным считается подход к оценке чувствительности и интерпретации результатов, предлагаемый Европейским комитетом по клиническим лабораторным стандартам (EUCAST), что заявлено в новом документе — Клинических рекомендациях, утвержденных в 2015 г. [7]. С 2014 г. постановка теста и оценка результатов производится нами в соответствии со стандартизованным EUCAST методом.

Учитывая высокие требования к условиям выполнения диско-диффузионного метода, обеспечивающие получение корректных результатов, рациональным явилось внедрение стандартизованного автоматического метода с помощью анализатора BIOMIC V3. Анализатор позволяет не только интерпретировать результат, но также дать экспертную оценку и провести клинико-эпидемиологический анализ полученных данных.

Известно, что заинтересованность специалистов в результатах своей деятельности является движущей силой ее совершенствования. Поэтому мы практикуем как проспективный, так и ретроспективный анализ всех направлений наших исследований. Основные виды диагностических исследований определяются преимущественно стандартами обследования пациентов разного профиля. Так, бактериологический анализ входит в алгоритм лабораторной диагностики при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), урогенитального тракта и мочевыводящих путей. Соответственно, исследования для выявления дисбактериоза кишечника, посевы мочи, отделяемого урогенитального тракта являются ведущими в структуре всех диагностических исследований.

Исследование состава флоры кишечника показано при многих заболеваниях ЖКТ (синдроме раздраженной кишки, неспецифическом язвенном колите и пр.), желчевыводящих путей, аллергических заболеваниях и выполняется в соответствии с действующим отраслевым стандартом [8]. В ходе исследования обычно оцениваются следующие основные показатели состояния микробиоты кишечника:

  • уровень содержания бифидобактерий как одних из основных анаэробных представителей облигатной микрофлоры;
  • уровень содержания популяции лактобацилл;
  • качественные и количественные характеристики популяций кишечной палочки и энтерококка;
  • количественное соотношение анаэробов с факультативно-анаэробными и строго аэробными микроорганизмами;
  • уровень колонизации условно-патогенными микроорганизмами;
  • количество спорообразующих анаэробов рода Клостридии.

В целях усовершенствования общепринятого подхода к технологии исследования и оценке результатов нами были привнесены следующие дополнения: более углубленное изучение в составе микробиоты компонента клостридий; обнаружение (по показаниям) токсинов А и В Clostridium difficili (экспресс-тест); проведение в ряде случаев целенаправленного анализа на бактероиды. Многолетний опыт работы показал, что качественный и количественный состав микрофлоры кишечника у наших пациентов отличается большим своеобразием и при интерпретации результатов часто возникают затруднения, т. к. рекомендованная отраслевым стандартом оценка тяжести микробиологических нарушений является весьма схематичной. Поэтому при обработке конкретных данных мы посчитали целесообразным частично пересмотреть градации по степеням тяжести микробиологических нарушений и учитывать, кроме I, II и III степени дисбактериоза, промежуточные состояния, обозначенные как I–II и II–III степень.

Анализ микробиоты у пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта

Некоторые результаты анализа наших исследований представлены ниже.

Подвергнуты анализу методом случайной выборки 1390 микробиологических карт пациентов с различными заболеваниями ЖКТ (синдром раздраженной кишки, неспецифический язвенный колит и пр.), обследование которых проведено по направлению врачей-гастроэнтерологов. Интересно отметить, что показатели состояния микробиоты у пациентов за последние 2 года оказались хуже в сравнении с предыдущим периодом наблюдения. Поэтому мы разделили результаты на 2 периода наблюдения: в 1-й период 2012–2013 гг. вошли результаты анализов 950 больных, во 2-й период 2014–2015 гг. — 440 больных. Возрастной состав обследованных включал лиц трудоспособного возраста (от 18 до 60 лет) — 62,6% и старше 60 лет — 37,4%.

Распределение результатов микробиологических исследований по степеням выраженности дисбактериоза представлено на рис. 1.

Рис. 1. Частота обнаружения дисбактериоза с дифференциацией по степени тяжести нарушений микробиоты кишечника у пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (за два периода наблюдения — 2012–2013 и 2014–2015 годы)

Глубокие нарушения, соответствующие II, II–III и III степени дисбактериоза кишечника обнаружены в 20,0 (2012–2013 гг.) и 34,4% (2014–2015 гг.) случаев. Микроэкология этих пациентов характеризовалась прежде всего резким угнетением популяций бифидобактерий и лактобацилл, играющих ключевую роль в механизмах колонизационной резистентности, детоксикации и иммунной защиты. По нашим наблюдениям, в 2014–2015 гг. состояние нормоценоза кишечника у пациентов обнаруживалось в 2 раза реже, чем в предшествующий период (10,7 и 26,0% соответственно). Та же зависимость характерна для пациентов с начальными (I степенью) проявлениями нарушений микробиоты кишечника.

Следует отметить, что пациенты с I и I–II степенью дисбактериоза имеют хорошие перспективы при проведении грамотной коррегирующей терапии с использованием наиболее физиологичных биопрепаратов, в частности бактериофагов, пребиотиков и пробиотиков.

Частота обнаружения отдельных микроорганизмов в составе микробиоценоза кишечника колебалась по годам в значительных пределах, например, виды рода Enterobacter встречались с частотой 7,0–16,0%, Clostridium perfringens — 8,0–14,0%. Escherihia coli с гемолитической активностью — 13,0–26,0%.

В количественном отношении основными представителями облигатной микрофлоры кишечника являются бактероиды, играющие важную роль в процессе пищеварения, утилизации желчных кислот и липидном обмене. Однако ввиду трудности их культивирования на практике в схему исследования для выявления дисбактериоза эти анаэробные микроорганизмы обычно не включаются.

С целью определения уровня бактероидов как индигенной фракции микробиоты кишечника нами были проведены исследования кала с применением техники анаэробного культивирования у 95 пациентов с синдромом раздраженной кишки и др. В результате выделены и идентифицированы разные виды бактероидов, в т. ч. B. fragilis, B. distasonis, B. vulgatus и др. Частота обнаружения бактероидов составила всего 41,8%. При этом только у 25,0% обследованных пациентов популяция бактероидов присутствовала в количестве, соответствующем возрастной норме.

Отсутствие бактероидов у большинства больных (58,2% обследованных) предположительно может свидетельствовать о высокой лабильности этих микроорганизмов и сильной зависимости от внутренних и наружных неблагоприятных факторов. Низкий уровень бактероидов может служить индикатором глубоких нарушений микробиоценоза.

Анализ микробиоты у пациентов с урогенитальными инфекционно-воспалительными заболеваниями

Для лабораторной диагностики урогенитальных инфекционно-воспалительных заболеваний нами разработан алгоритм исследований, включающий:

  • культуральные методы в направлении поиска всех групп приоритетных условно-патогенных микроорганизмов, включая строгие анаэробы, микоплазмы и грибы;
  • метод микроскопии нативного биоматериала;
  • экспресс-метод с целью обнаружения стрептококков группы В (S. agalaciiae);
  • определение чувствительности выделенных возбудителей (бактерий, микоплазм и грибов) ко всем поколениям антибактериальных и антимикотических препаратов, что дает возможность осуществить целенаправленную тактику лечения.

С начала пубертатного периода у женщин лактобактерии становятся доминирующими микроорганизмами во влагалище и сохраняют это положение на протяжении всего репродуктивного периода.

Лактофлора является определяющим фактором, обеспечивающим стабильность вагинальной экосистемы и устойчивость к различного рода инфекциям. Совокупность методов позволила обнаружить присутствие популяций лактобацилл во влагалищном секрете у 78,8% обследованных женщин репродуктивного возраста с признаками воспаления. При этом уровень содержания лактобацилл только в половине случаев соответствовал нормальным количественным показателям. Новые возможности в изучении микробиоценозов появились с внедрением инновационного метода масс-спектрометрии. Использование преимуществ культурального посева в сочетании с масс-спектрометрическим анализом позволило определить видовой состав лактобацилл, колонизирующих влагалищный биотоп. Обнаруженные впервые Додерлейном в конце XIX в. в вагинальном мазке грамположительные палочки ассоциировались до недавнего времени с Lactobacillus acidophilus. В свете последних научных исследований [2] показано, что в организме здоровой женщины репродуктивного возраста лактофлора представлена преимущественно видом L. crispatus, продуцирующим перекись водорода и молочную кислоту. Наличие объективных признаков воспаления обычно коррелирует с выявлением L. gasseri или L. iners.

В 2013–2015 гг. нами было выделено из влагалищного отделяемого обследованных женщин 408 изолятов рода Lactobacillus и идентифицировано более 14 видов лактобацилл, некоторые из которых могли быть участниками инфекционно-воспалительного процесса в генитальной сфере (рис. 2).

Рис. 2. Частота обнаружения различных видов лактобацилл во влагалищном секрете обследованных женщин

Для интегральной оценки состояния микробиоценоза влагалища мы использовали общепринятый алгоритм исследования, включающий определение следующих параметров: уровень содержания лактобацилл, количество лейкоцитов в поле зрения, состав и количество условно-патогенных микроорганизмов, наличие и количество грибов рода Candida, присутствие коккобациллярных форм, наличие «ключевых» клеток.

В основу исследований положены технологии, разработанные в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» под руководством д-ра мед. наук проф. А.С. Анкирской [1].

Были подвергнуты ретроспективному анализу данные микробиологических исследований отделяемого влагалища 603 женщин с признаками воспаления, а также с симптомами болезни невоспалительного характера, находящихся под амбулаторным наблюдением врача-гинеколога в течение 2012–2015 гг. Полученные данные позволили выделить группы женщин с процессами инфекционно-воспалительного характера и другими патологическими состояниями.

Результаты исследования микробиоценоза биотопа влагалища женщин представлены на рис. 3.

Рис. 3. Результаты исследования микробиоценоза биотопа влагалища обследованных женщин

Серьезную проблему представляет лечение больных с хроническими и отягощенными воспалительными заболеваниями мочевыводящих путей в связи с высокой устойчивостью микроорганизмов — уропатогенов к антибактериальным препаратам. Именно такой контингент больных обращается за помощью в наше учреждение [12]. Так, среди обследованных были лица с диагнозами: хронический пиелонефрит — 51,8% случаев, хронический цистит — 17,9%, клинические формы неуточненной локализации — 30,3% случаев. Отмечено, что большое число обследованных (порядка 42,0%) имели осложненные формы заболевания.

В результате мониторинга результатов микробиологических исследований на протяжении 15 лет (2001–2015 гг.) получены данные о частоте обнаружения различных групп микроорганизмов, которые с учетом степени бактериурии оценивались как возбудители инфекций мочевыводящих путей.

Всего подвергнуты анализу результаты микробиологического исследования более 10 тыс. образцов мочи. Основными возбудителями за многолетний период наблюдений неизменно являлись такие условно-патогенные микроорганизмы, как кишечная палочка, клебсиелла и энтерококк (рис. 4).

Рис. 4. Структура возбудителей воспалительных заболеваний мочевыводящих путей у пациентов амбулаторного приема

Своевременная этиологическая диагностика с определением индивидуальной антибиотикограммы выделенных штаммов играет решающее значение в выборе тактики целенаправленной терапии [9]. Профиль антимикробной резистентности выделенных культур кишечной палочки, по данным двух выборочных периодов наблюдения с десятилетним временным промежутком, представлен на рис. 5.

Рис. 5. Результаты изучения антибиотикорезистентности культур кишечной палочки, выделенной из мочи амбулаторных пациентов в 2005 и 2015 году (по оси ординат — процент резистентных культур)

На диаграмме прослеживается рост резистентности урокультур кишечной палочки ко всем группам антибиотиков, которые широко используются в урологической практике. Особую проблему создает увеличение доли (более 30,0%) штаммов, резистентных к фторхинолонам, которые являются препаратами выбора при инфекциях мочевыводящих путей.

Урокультуры K. pneumoniae (изучено 200 культур) отличались полирезистентностью к большинству используемых препаратов, с особенно высокой частотой устойчивости к нитрофурантоину (рис. 6).

Рис. 6. Антибиотикорезистентность урокультур клебсиелл в 2015 году

Приведенные данные являются отражением состояния антибиотикорезистентности возбудителей инфекций мочевыводящих путей у амбулаторных пациентов в конкретном ЛПУ и в определенной степени Нижегородском регионе в целом. Полученные результаты будут чрезвычайно полезны для определения стратегии и тактики применения антибактериальных препаратов в клинической практике.

Учитывая присутствие в нашей жизни многочисленных неблагоприятных внешних факторов, влияющих, возможно, в первую очередь на иммунитет и микроэкологию организма человека, клиническая микробиология в перспективе должна приобрести особую актуальность. Пути развития микробиологической практики видятся в укреплении и укрупнении лабораторных баз; соединении в единый комплекс всех современных методов, направленных на поиск микробных агентов; объединении усилий микробиологов, фармакологов, эпидемиологов и клиницистов; создании региональных центров по мониторингу антибиотикорезистентности клинических изолятов; разработке новых нормативных документов взамен устаревших.

Список использованной литературы

1. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Интегральная оценка состояния микробиоты влагалища. Диагностика оппортунистических вагинитов (медицинская технология). М., 2011. 20 с.

2. Ворошилина Е.С. Совершенствование методических подходов к оценке микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста. Автореферат дисс. на соиск. уч. ст. д-ра мед. наук. Челябинск, 2012. 37 с.

3. ГОСТ Р ИСО 15 189-2009. Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности.

4. Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. Том II. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2013. 805 с.

5. Методики клинических лабораторных исследований. Т. 3. Клиническая микробиология / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Лабора. 2009. 880 с.

6. МУК 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», утв. Главным государственным санитарным врачом РФ. 91 с.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: клинические рекомендации. Утв. на расширенном совещании Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. Москва, 22 мая 2015 г.

8. Приказ Минздрава России от 09.06.2003 № 231. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». 73 с.

9. Синякова Л.А., Косова И.В. Антимикробная терапия неосложненных инфекций мочевых путей // Consillium medicum. 2014. № 7. С. 3–6.

10. Тартаковский И.С. Микробиологические исследования. Методическое пособие «Организация и нормативно-правовое обеспечение лабораторной службы. Инновационное развитие лабораторной медицины в России». М., 2014 . С. 82–83.

11. Тарасов Ю.И., Усачева С.Ю. Пути оптимизации и совершенствования деятельности лабораторий клинической микробиологии (опыт нижегородских бактериологов): материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология — XXI век». Саратов, 2004. C. 216–217.

12. Усачева С.Ю., Бандорина О.Л., Мозжухина Е.А. и др. Практическая значимость этиологической диагностики при инфекционно-воспалительных заболеваниях мочевыводящих путей // Нижегородский медицинский журнал. № 3. 2006. С. 43–47.

13. Шлегель Г.Г. История микробиологии. М.: Эдиториал УРСС. 2006. 266 с.

Факторы роста, их рецепторы и нижележащие сигнальные белки в клинической онкологии: достижения, проблемы, перспективы
№ 9, 2016