Проведение внутрилабораторного контроля качества неколичественных методов иммуноферментного анализа при наличии и отсутствии контрольных материалов

Ранее авторами был описан способ проведения внутрилабораторного контроля качества (ВКК) неколичественных методов иммуноферментного анализа при использовании коммерческих контрольных образцов (КО). Данный способ включает построение контрольной карты и последующий оперативный контроль [1, 2]. Этот вариант подходит для лабораторий, в которых анализ соответствующего маркера проводится ежедневно. Для лабораторий, которые выполняют анализы таких маркеров 1–3 раза в неделю, предложенный метод проведения ВКК трудновыполним. Построение контрольной карты растягивается на месяцы, кроме того, за это время заканчивается одна серия набора реагентов для выявления конкретного маркера, появляется другая, встает вопрос о проведении новой установочной серии и т. д.

В таком случае ВКК должен состоять в оценке внутрисерийной сходимости методики (выполняется периодически) и в оценке чувствительности и специфичности анализа (выполняется в каждой аналитической серии). Для оценки внутрисерийной сходимости методики необходимо провести 10 измерений КО, содержащих маркеры соответствующих инфекций в одной аналитической серии (10 лунках одного планшета). Кроме того, в этой же аналитической серии выполняются измерения КО для проверки чувствительности и специфичности анализа – КО, содержащих и не содержащих анализируемые маркеры, положительных и отрицательных соответственно. Оптическая плотность (ОП) положительных КО должна превышать ОП крит, ОП отрицательных КО должна быть ниже ОП крит.

Если результаты определения положительных и отрицательных КО не являются таковыми, значения КО и других образцов, исследованных в этой аналитической серии, не принимаются. Необходимо найти и устранить ошибки, провести анализ всех образцов повторно.

Значения КО и других образцов, исследованных в аналитической серии, принимаются, если результаты определения положительных и отрицательных КО соответствуют заданным. На основе 10 значений ОП КО следует рассчитать коэффициент внутрисерийной вариации методики CV10 и при использовании КО производства ЗАО «Вектор-Бест» сравнить с данными таблицы (табл. 1). Вычисленные значения CV10 в этих случаях не должны превышать значений, приведенных в таблице. Если вычисленное значение CV10 для исследованного маркера выше установленного, это сигнализирует об ошибках при выполнении анализа. В этом случае необходимо найти и устранить ошибки и провести повторный анализ всех образцов. Соответствие показателей внутрисерийной вариации методики значениям, приведенным в таблице, свидетельствует об удовлетворительном качестве анализа. Лаборатория должна решить, с какой периодичностью проверять внутрисерийную вариацию методики, например, такую проверку можно проводить один раз в три месяца.

Таблица 1

Значения 95% доверительного интервала для индивидуальных значений коэффициента вариации CV, рассчитанные по результатам измерений определяемого показателя в контрольных материалах, содержащих маркеры гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции, в лабораториях России в рамках программы внешней оценки качества ЗАО «Вектор-Бест»

Проверка чувствительности и специфичности анализа в лаборатории проводится в каждой аналитической серии. Для этого наряду с контролями набора реагентов в одну лунку вносится положительный КО, в одну лунку – отрицательный КО, в остальные лунки – исследуемые образцы крови пациентов. Если результаты определения положительных и отрицательных КО не являются таковыми, значения исследуемых образцов этой аналитической серии не принимаются. Необходимо найти и устранить ошибки и провести анализ со всеми образцами повторно. Значения исследованных образцов принимаются и оцениваются согласно инструкции по применению набора реагентов, если результаты определения положительных и отрицательных КО соответствуют заданным.

В практике лабораторий часто возникает вопрос: как проводить ВКК для маркеров, контрольные материалы для которых не разработаны или недоступны? Если обратиться к определению термина «внутрилабораторный контроль качества», то согласно ГОСТ Р 53133.3-2008 «Контроль качества клинических лабораторных исследований» ВКК – это система процедур, проводимых с применением контрольных материалов или на основе статистического анализа результатов исследований проб пациентов для оценки характеристик аналитического качества используемых методик исследования с целью удовлетворения требований по качеству и повседневного мониторинга стабильности результатов [3].

Следовательно, в случае отсутствия контрольных материалов возможно проведение ВКК на основе статистического анализа. Для этого можно использовать рекомендацию ГОСТ Р 53022.2-2008 «Контроль качества клинических лабораторных исследований», раздел 3.8 «Правила оценки аналитической надежности неколичественных методов клинических лабораторных исследований»: в отношении визуальных неколичественных методов применяют оценку по частоте обнаружения с их помощью искомых компонентов для специфических форм патологии, для диагностики которых предназначен данный вид исследования.

Итак, будем использовать понятие частоты выявления маркера. В ГОСТ Р 50779.42-00 «Статистические методы. Контрольные карты Шухарта» (раздел 9 «Контрольные карты для альтернативных данных») описано построение р-карты частот [4]. Следует отметить, что понятие «альтернативные данные» как нельзя лучше отражает полученные результаты неколичественных исследований. Ведь альтернативные данные представляют собой наблюдения, фиксирующие наличие или отсутствие некоторых характеристик (например маркера) у каждой единицы (образец крови пациента) рассматриваемой подгруппы (аналитическая серия). На основе этих данных производится подсчет числа единиц, обладающих или не обладающих данным признаком (частота обнаружения определяемого маркера в образцах крови, исследованных в одной аналитической серии). Формула контрольных границ для контрольных карт, использующих альтернативные данные:

где Рср – среднее значение доли несоответствующих единиц (содержащих маркер);

σ – истинное внутригрупповое стандартное отклонение.

В табл. 2 приведены ретроспективные данные, полученные в клинико-диагностической лаборатории муниципальной инфекционной клинической больницы № 1 г. Новосибирска при исследовании образцов крови пациентов для выявления маркеров инфекционных заболеваний – антител к ядерному антигену вируса гепатита В класса М – анти-HBcIgM. Исследования проводились с использованием наборов реагентов одного изготовителя. Из данных таблицы видно, что число образцов крови пациентов, для которых выполнен анализ, варьирует от 38 до 88, т. е. может отличаться в два раза, а иногда и более. В таких случаях, когда объем подгруппы существенно меняется, стандартом предусмотрено нормирование переменных. Формула для нормирования переменных:

Двадцать – двадцать пять подгрупп (аналитических серий) объемом 4 или 5 (число образцов крови пациентов) рассматриваются как приемлемые для получения предварительных оценок. Предварительные данные должны быть собраны последовательно, пока не будет получено 20–25 подгрупп при непрерывном ходе процесса, который должен быть достаточно стабилен. Для уверенности в стабильности процесса необходимо использовать стандарты, контрольные материалы (слитые сыворотки) при выполнении 20 аналитических серий, по которым будет строиться р-карта частот, т. к. это повышает надежность установленных пограничных пределов.

Таблица 2

Частота выявления анти-НВсIgM в образцах крови пациентов, исследованных в 34 аналитических сериях, с 11.05.2012 по 23.01.2013, при использовании набора реагентов ВектоНВсАg-IgM

В табл. 2 приведены данные исследований в 34 аналитических сериях, количество образцов в каждой не меньше четырех. Можно вычислить частоты выявления положительных образцов, содержащих маркер, в каждой аналитической серии и провести нормирование. После нормирования частот выявления положительных образцов строим р-карту частот (рисунок), с помощью которой можно проводить ВКК по выявлению этого маркера¹. По данной р-карте частот выявления анти-HBcIgM за указанный период можно сказать, что процесс стабилен, нет выходов даже за предупредительные границы, качество анализов удовлетворительное.

Р-карта нормированных частот выявления образцов крови, содержащих анти-НВсIgM, в 34 аналитических сериях; по результатам первых 20 аналитических серий установлены предупредительные и контрольные границы (их частоты также нанесены на карту)

Если частота выявления положительных образцов, содержащих маркер, выходит за нижние контрольные границы, необходимо найти ошибки и устранить их, затем проанализировать повторно образцы, которые были оценены как отрицательные. Возможно, повторное исследование некоторых даст положительный результат. Если частота выявления положительных образцов, содержащих маркер, выходит за верхние контрольные границы, необходимо также найти ошибки и устранить их, затем проанализировать повторно образцы, которые были оценены как положительные. Возможно, повторное исследование некоторых даст отрицательный результат. Нельзя забывать о том, что ошибки и их влияние на результат анализа могут быть разнонаправленными. В таком случае необходимо повторить исследование всех образцов данной аналитической серии.

Что может повлиять на частоту выявления того или иного маркера? В первую очередь контингент обследуемых групп пациентов. При исследовании образцов крови условно здорового населения (например, в случае медицинского осмотра) частоты выявления тех или иных маркеров инфекционных заболеваний будут низкими, т. е. могут выходить за нижние контрольные пределы, но это не значит, что такие образцы должны быть исследованы повторно. На частоту выявления маркера могут влиять: время обследования (сезон), т. к. в периоды массовых летних отпусков меньше обращений населения в ЛПУ; смена изготовителя наборов реагентов, которые используются для выявления маркера; ошибки при выполнении исследований и т. д. Все эти факторы необходимо учитывать в процессе ВКК с помощью контрольных р-карт. Несмотря на необходимость учета всего множества перечисленных факторов, р-карта является инструментом, позволяющим преобразовать интуитивную оценку качества анализа в измеримые величины.

Таким образом, для осуществления ВКК с использованием контрольных материалов в лабораториях с довольно низкой частотой проведения анализов (1–3 раза в неделю) при выявлении маркеров социально значимых инфекций необходимо в каждой аналитической серии проверять чувствительность и специфичность лабораторного анализа с помощью контрольных материалов. Контрольный материал для оценки внутрисерийной сходимости измерений применяется периодически, контрольная карта не строится.

В том случае, если контрольные материалы для проведения ВКК отсутствуют, возможно использование контрольной р-карты частот выявления положительных образцов крови, содержащих исследуемые маркеры.

Авторы выражают благодарность Мельниковой О.В., заведующей лабораторией КДЛ Муниципальной инфекционной клинической больницы № 1 г. Новосибирска.

Список использованной литературы