Внутрилабораторный контроль качества неколичественных методов иммунохимического анализа для выявления иммунологических маркеров инфекционных заболеваний
Внутрилабораторный контроль качества (ВКК) — система процедур с применением контрольных материалов или на основе статистического анализа результатов исследований проб пациентов для оценки характеристик аналитического качества используемых методик исследования с целью удовлетворения требований по качеству и повседневного мониторинга стабильности результатов. Система процедур ВКК служит для поддержания стабильности аналитической системы (совокупности приборов, калибраторов, реагентов и расходных материалов, необходимых для выполнения измерения аналита) [1].
Скрининговые неколичественные исследования методом иммунохимического анализа (ИХА) оперируют количественными данными, но вместо непрерывных значений исследуемого параметра получают данные, имеющие бимодальное распределение — отрицательные и положительные результаты. Это свойство определяет и особенности проведения ВКК для таких методов.
Аналитическая надежность неколичественных методов исследований оценивается по частоте обнаружения исследуемых компонентов, характерных (по морфологии, химическому или биологическому сродству с определенными хромофорами, флуорофорами, антителами) для специфических форм патологии, для диагностики которых предназначен данный вид исследования [2].
Контрольные карты Шухарта для альтернативных данных, фиксирующие наличие или отсутствие некоторых характеристик (серологических маркеров — авт. редакция) у каждой единицы (образца крови — авт. редакция) рассматриваемой подгруппы (аналитической серии — авт. редакция), позволяют подсчитать частоту выявления иммунологического маркера той или иной инфекции в аналитической серии [3].
Основным параметром карт для альтернативных данных является вычисленная средняя частота выявления инфекционного маркера по 20 установочным аналитическим сериям и вычисленные контрольные границы. Выход частоты выявления маркера текущей аналитической серии за верхние контрольные границы указывает на риск появления ложноположительных результатов, выход за нижние контрольные границы — ложноотрицательных результатов. Частота выявления маркера в образцах крови пациентов выступает индикатором качества и позволяет следить за рисками появления неправильных результатов исследований [4].
Еще одним индикатором качества выступает контрольный материал (КМ), содержащий инфекционный маркер (маркеры) в концентрации, «насколько это возможно, близко к значениям клинических решений, тем самым подтверждая валидность принятых решений» [4]. Применение КМ, содержащих маркер в низкой концентрации и не содержащих маркер, в каждой аналитической серии одновременно с исследуемыми пробами пациентов позволяет подтвердить аналитическую надежность результатов и принять решения по их выдаче.
Наборы реагентов для выявления инфекционных агентов, в том числе гепатитов В, С, D, ВИЧ-инфекции, в крови с целью возможности ее переливания являются медицинскими изделиями с высоким индивидуальным риском и (или) высоким риском для общественного здоровья, относятся к 3-му классу, поэтому риски неправильных результатов при проведении анализов должны быть минимизированы [5, 6, 7].
В данной статье даны рекомендации по организации ВКК неколичественных методов ИХА с помощью медицинских изделий для диагностики in vitro 3-го класса на основе частот выявления иммунологических маркеров в образцах крови пациентов.
Правила оценки аналитической надежности неколичественных методов исследований
Важнейшей составляющей качества исследований является их аналитическая надежность, характеризующая степень достоверности лабораторных данных об изучаемом аналите и тем самым определяющая возможность использования их при принятии клинических решений. Аналитическая надежность клинических лабораторных исследований характеризуется свойствами методов, которыми они выполняются:
а) для количественных методов: точностью (правильностью и прецизионностью) измерений, аналитической чувствительностью, аналитической специфичностью;
б) для неколичественных методов исследования — частотой совпадения обнаружения патологических отклонений изучаемого компонента биоматериала с объективно подтвержденным наличием соответствующего заболевания [2].
Таким образом, для организации ВКК с помощью статистических методов можно использовать такой параметр, как частота выявления иммунологического маркера в образцах крови пациентов.
Применение контрольных карт Шухарта для альтернативных данных
Контрольные карты Шухарта для альтернативных данных являются инструментом, позволяющим проводить ВКК неколичественных методов ИХА на основе статистического анализа результатов исследования иммунологического маркера в пробах пациентов. В случае неколичественных методов ИХА альтернативные данные представляют собой информацию о наличии или отсутствии исследуемого маркера в образцах крови пациентов одной аналитической серии. Частота выявления иммунологического маркера представляет собой долю первично положительных образцов в общем количестве исследуемых в данной аналитической серии образцов проб пациентов. Контрольные карты по этому признаку называются P-картами [3].
Основным параметром карт для альтернативных данных является средняя частота выявления иммунологического маркера Рср того или иного заболевания в лаборатории. Рср может зависеть от множества факторов, включая частоту распространения заболевания в регионе, контингент обследуемых групп населения, число исследуемых образцов крови пациентов в каждой аналитической серии, профиль ЛПУ, аналитические характеристики используемого набора реагентов и т. д. Для оценки среднего значения частоты необходимо последовательно собрать предварительные данные, пока не будет получено 20–25 аналитических серий при непрерывном ходе процесса, который должен быть достаточно стабилен. Использование стандартов, контрольных материалов (слитых сывороток) при проведении установочных аналитических серий, по которым строится P-карта частот, повышает надежность установленных пограничных пределов.
Рср = m: n, где m — количество выявленных первично положительных образцов, а n — общее количество исследованных в установочных (используемых для построения карты) сериях.
На основе значения Рср устанавливаются границы карты. Если объем подгрупп (число исследуемых образцов) меняется несущественно (±25% от целевого объема подгруппы), то можно ограничиться одним набором контрольных границ, основанным на среднем объеме подгруппы.
Формула контрольных границ для контрольных карт, использующих альтернативные данные:
Рср — среднее значение доли положительных образцов (частоты выявления маркера в лаборатории);
σ — истинное внутригрупповое стандартное отклонение;
n — количество исследуемых образцов в аналитической серии.
В лабораторной практике скрининговых исследований чаще всего наблюдается обратная ситуация, когда объем поступающих ежедневно образцов крови пациентов изменяется значительно (больше 25% целевого объема подгруппы). В этом случае применяют нормированные переменные.
Формула получения нормированных значений:
Рср. — среднее значение доли положительных образцов;
Р — значение частоты выявления маркера (доли положительных образцов) в текущей аналитической серии;
n — количество исследуемых образцов в аналитической серии.
При использовании нормированных переменных центральная линия контрольной P(Z)-карты соответствует Z = 0, линии предупредительных границ соответствуют значениям Z = 2, Z = -2, контрольных границ Z = 3, Z = -3. Центральная линия и контрольные границы остаются постоянными независимо от объема подгруппы.
Суть процедуры ВКК по контрольным P(Z)-картам частот состоит в отслеживании аналитических серий с нормированными частотами выявления маркера, выходящими за верхние и нижние предупредительные или контрольные границы карты. В таких случаях количество первично положительных образцов в аналитической серии значительно больше (выход за 3) или меньше (выход за -3) установленного среднего. Выход за верхние границы карты говорит о том, что существует риск появления ложноположительных результатов, выход за нижние границы указывает на риск ложноотрицательных результатов.
Значение нормированной частоты Z зависит от средней частоты выявления маркера и количества исследуемых образцов в каждой аналитической серии. При низких частотах выявления маркера и (или) малом числе образцов для исследования, нижним пределом P(Z)-карты будет значение, соответствующее частоте Р = 0, а не нижние контрольные -3 или предупредительные границы -2. Другими словами, значение нормированной частоты Zi, вычисленное для частоты данной аналитической серии Pi = 0, не будет достигать нижней контрольной границы -3 или даже предупредительной -2. При таком ограничении невозможно оценить риск получения ложноотрицательных результатов.
Чтобы нормированная частота Zi i-й аналитической серии с нулевой частотой выявления маркера (Рi = 0) попала на контрольные границы -2 или -3, в аналитической серии необходимо не менее n образцов крови пациентов, которое можно вычислить, преобразовав формулу:
если Zi = -3, Pi = 0, то n = 9 x (1 — Pср) / Рср;
если Zi = -2, Pi = 0, то n = 4 x (1 — Pср) / Рср.
Взаимосвязь числа исследуемых образцов в аналитической серии со средней частотой выявления маркера Рср приведена в таблице.
Связь числа исследуемых образцов в аналитической серии со средней частотой выявления маркера Рср
| Частота выявления маркера, % | Количество исследуемых образцов для контроля Р = 0 на границе -3 | Количество исследуемых образцов для контроля Р = 0 на границе -2 |
|---|---|---|
| 1 | 891 | 396 |
| 2 | 441 | 196 |
| 3 | 291 | 129 |
| 4 | 216 | 96 |
| 5 | 171 | 76 |
| 6 | 141 | 63 |
| 7 | 120 | 53 |
| 8 | 104 | 46 |
| 9 | 91 | 40 |
| 10 | 81 | 36 |
| 15 | 51 | 23 |
| 20 | 36 | 16 |
Например, при средней частоте выявления маркера 2% для контроля риска ложноотрицательных результатов в i-й аналитической серии без положительных результатов выявления маркера (Рi = 0), чтобы вычисленная для этой i-й аналитической серии нормированная частота Zi вышла за нижнюю границу -3 (Zi > -3), необходимо в каждой аналитической серии исследовать больше 441 образца крови. Если решено использовать вместо контрольного предела -3 предупредительные границы -2, то необходимое минимальное число образцов для анализа снижается в 9/4 раза и должно быть больше 196.
При увеличении частоты выявления маркера предельное число исследуемых образцов в одной аналитической серии уменьшается, например, при частоте 5% и принятом критерии контроля вероятности ложноотрицательных результатов -2 достаточно взять больше 76 образцов крови пациентов в одно исследование. При критерии -3 необходимо исследовать более 171 образца в одной аналитической серии, чтобы контролировать риск появления ложноотрицательных результатов.
Дополнительный параметр карты — медиана частоты выявления маркера. Медиана — это значение признака, справа и слева от которого находится равное число наблюдений (по 50%). В случае нормального распределения медиана совпадает со средним арифметическим значением. Значение медианы частоты выявления маркера, равное нулю, означает, что в 10 и более из 20 установочных серий нет положительных результатов выявления маркера. В таком случае проведение ВКК по частоте выявления маркера невозможно.
Если контрольную карту строят впервые, то часто оказывается, что процесс статистически не управляем. Среднее значение и контрольные границы, рассчитанные на основе такого процесса, будут иногда приводить к ошибочным заключениям, поскольку могут оказаться неправильно установленными.
На P(Z)-карте частот выявления HBsAg, построенной по данным КДЛ (рисунок), виден тренд, то есть тенденция повышения частоты выявления маркера с 11.10.2017 по 06.12.2017 после проведения установочной серии по ретроспективным данным с 25.08.2017 по 09.10.2017 и определения параметров карты (среднего значения и границ).
Кликните на картинку, чтобы увеличить
Z-карта частот выявления HBsAg, по данным из КДЛ, нанесены нормированные частоты 51 аналитической серии. По первым 20 установочным сериям вычислена средняя частота Рср.=0,05, для которой нормированная частота Z=0 (сплошная линия), и контрольные границы, для которых нормированная частота Z=3 со знаком плюс или минус. Средняя частота для следующих 31 аналитической серии Рср.=0,13, Z=1,51 также нанесена на карту в виде штрихпунктирной линии.
По 20 установочным сериям была установлена средняя нормированная частота Z = 0 (Рср = 0,05), верхняя контрольная граница 3, нижняя -3. Если вычислить среднюю нормированную частоту по следующим 31 аналитическим сериям, то Z = 1,51 (Рср = 0,13), то есть появляется сдвиг центральной линии карты вверх. При обнаружении тренда (возрастания или убывания параметра карты) необходимо пересмотреть все этапы и результаты анализов, добавить другие индикаторы качества (например, КМ, не содержащие и содержащие целевой маркер в низкой концентрации) при проведении последующих исследований, чтобы убедиться в их аналитической надежности. Также важной является проверка соответствия выявленного или, наоборот, невыявленного иммунологического маркера с клинической картиной специфических форм патологии, для диагностики которых предназначено данное исследование. В зависимости от полученных в ходе проверки результатов предпринять корректирующие действия.
Принципы организации ВКК по частоте выявления иммунологического маркера в образцах крови пациентов
Таким образом, чтобы организовать ВКК по частоте выявления иммунологического маркера в образцах крови пациентов, необходимо:
- по ретроспективным данным выяснить средние значения частоты выявления первично положительных образцов и количество исследуемых образцов в одной аналитической серии. Если более чем в 50% аналитических серий иммунологический маркер не выявляется и медиана частоты равна нулю, невозможно проводить ВКК по частоте, необходимо использовать КМ или слитые сыворотки для оценки аналитической надежности исследований;
- сопоставить полученные значения со значениями, приведенными в таблице. Выяснить, сколько образцов крови пациентов необходимо исследовать в одной аналитической серии, чтобы контролировать риск получения ложноотрицательных результатов по P(Z)-карте.
Следует иметь в виду:
а) возможно объединение числа исследуемых образцов крови пациентов нескольких аналитических серий, выполненных в течение рабочего дня при сохранении одинаковых условий проведения анализа. Оценка и выдача результатов в таком случае проводится после оценки объединенной частоты выявления иммунологического маркера;
б) другой случай увеличения числа исследуемых образцов крови пациентов — накопление образцов в течение нескольких дней до исследования, но не в ущерб своевременности выдачи результатов;
в) если невозможно увеличение числа образцов крови пациентов в аналитической серии, то необходимо использовать КМ или слитые сыворотки для оценки аналитической надежности исследований.
Список нормативных документов
1. ГОСТ Р 53133.1-4-2008 Контроль качества клинических лабораторных исследований.
2. ГОСТ Р 53022.1-4-2008 Требования к качеству клинических лабораторных исследований.
3. ГОСТ Р ИСО 7870-2-2015 Статистические методы. Контрольные карты Шухарта.
4. ГОСТ Р ИСО 15189–2015 Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности.
5. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 12.02.2016 № 27 «Об утверждении Общих требований безопасности и эффективности медицинских изделий, требований к их маркировке и эксплуатационной документации на них».
6. Приказ Минздрава от 06.06.2012 № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий».
7. ГОСТ Р ИСО 18113.1–2015 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины, определения и общие требования.
