Опыт использования определения уровня гиалуроновой кислоты в диагностике заболеваний печени

Во многих развивающихся странах заболевания печени входят в первую пятерку, а цирроз и рак печени — в первую десятку причин смертности. Диагностика и мониторинг динамики хронических заболеваний печени (ХЗП) — одна из самых актуальных задач современной гепатологии. Основной путь прогрессирования хронических диффузных заболеваний печени, приводящий к ее повреждению, — это процесс активации фиброгенеза [3, 4, 7, 23]. За последние три десятилетия оценка значения фиброза печени (ФП) в практической медицине претерпела кардинальные изменения: от «стабильного состояния, отражающего излечение с анатомическим дефектом», до «жизненно важного, динамичного синдрома практической гепатологии, определяющего прогноз больных с хроническими заболеваниями печени» [14, 17]. Традиционный взгляд на цирроз печени (ЦП) как на обязательный и необратимый этап фиброза, развивающегося при хроническом гепатите вне зависимости от этиологического фактора, в последние годы вызывает сомнение [18]. Ряд авторов предлагают выделять стадию «обратимого цирроза печени». Существуют экспериментальные доказательства обратимости процессов фиброза/цирроза печени [5, 13]. В этой связи ранняя диагностика, разработка и внедрение малоинвазивных, эффективных и доступных методов оценки выраженности и темпов прогрессирования фиброза/цирроза печени, представляются очень важной задачей для современной практической гепатологии [3, 9].

За последнее десятилетие значительные усилия были направлены на развитие неинвазивных тестов оценки ФП. Существенные преимущества современных методов неинвазивной диагностики перед биопсией печени — простота, информативность на любой стадии фиброза, возможность проследить динамику процесса и применять как скрининг-метод для пациентов групп риска, в том числе в амбулаторных условиях, что принципиально важно для определения ранних стадий заболевания, своевременного назначения терапии и предотвращения дальнейшего прогрессирования фиброза [6, 12].

Разработки неинвазивных методов диагностики фиброза ведутся в нескольких направлениях. В настоящее время предложено несколько десятков биохимических показателей, претендующих на роль маркеров ФП [6, 8, 9, 10, 12, 16, 17, 20].

Маркеры фиброза, присутствующие в сыворотке крови (сывороточные маркеры), преимущественно характеризуют динамику и скорость процесса развития соединительной ткани в печени. Такие маркеры фиброза условно разделяют на две группы: прямые (класс 1) или биохимические показатели, которые экспрессируются внеклеточным матриксом печени и измеряются с помощью специальных методик в сыворотке крови, и непрямые (класс 2), к которым можно отнести показатели рутинных лабораторных тестов [9].

Прямые маркеры — молекулы, характеризующие метаболизм внеклеточного матрикса (фиброгенез и фибролиз) и/или изменения в стеллатных клетках, которые доминируют в профиброзных клетках. Такие биомаркеры фиброза — фрагменты клеточного матрикса печени, образованные стеллатными клетками, и молекулы, участвующие в регуляции прогрессии и регрессии фиброза. Они отражают распространенность и выраженность ФП и дают оценку содержанию, степени развития и характеру распределения внеклеточного матрикса в печени. По мнению некоторых исследователей, прямые сывороточные маркеры фиброза обладают большей точностью, чувствительностью и специфичностью для диагностики и дифференциации стадий фиброза по сравнению с непрямыми и позволяют выделить категории пациентов с умеренным (F1-F2 по METAVIR) и тяжелым фиброзом (F3-F4 по METAVIR) [11].

Одним из представителей прямых маркеров фиброза в сыворотке крови является гиалуроновая кислота (ГК) — полисахарид, присутствующий в экстрацеллюлярном матриксе. Уровень ГК положительно коррелирует со степенью повреждения печени, что позволяет оценивать степень фиброза [2, 8, 15]. Однако данные по концентрации ГК при патологии печени неоднородны. По одним данным, уровень ГК позволяет диагностировать минимальный фиброз при хронических гепатитах, а при переходе заболевания в стадию цирроза выявлять выраженный фиброз (точка разделения 183,5 нг/мл с чувствительностью 80 процентов и специфичностью 80 процентов по сравнению с биопсией) [21]. По данным других авторов, уровень ГК для дифференциации фиброза при хроническом гепатите вирусной этиологии от цирроза печени (ЦП) составляет 100–102,0 нг/мл при чувствительности 100 процентов, специфичности 80–84,6 процента и эффективности 88 процентов. Точка разделения ГК для диагностики фиброза у пациентов с гепатитом от здоровых составляет 59,5 нг/мл [8]. В одной из ранних работ Д. А. Гусева [2] при сравнительном анализе средних показателей ГК в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С (ХГС) установлено, что между пациентами в стадиях Fl и F2 отсутствовали статистически значимые различия. Однако при сравнении как показателей стадий Fl с F3, F4, так и стадий F2 с F3, F4 отмечались достоверно значимые различия. Значения ГК в группах тяжелого фиброза и цирроза составляли 70,7±11,7 нг/мл и 258,2±95,7 нг/мл (р<0,01) [2]. По данным P. Halfon et al [15], определение уровня ГК в сыворотке крови у больных ХГС позволяет с высокой точностью дифференцировать умеренный (F1-F2), тяжелый (F3-F4) фиброз и ЦП. Содержание ГК в крови >237 мкг/л диагностирует ЦП со специфичностью 99 процентов при прогностической ценности положительного результата 57 процентов, а значение ≤50 мкг/л исключает наличие цирроза при прогностической ценности отрицательного результата 100 процентов [15]. Главная ценность определения уровня ГК, по мнению многих исследователей, заключается в возможности исключить тяжелый фиброз (F3) и ЦП. Отрицательное прогностическое значение возможности исключить выраженный фиброз и ЦП составляет, по разным данным, 89–93 процента и 93–100 процентов соответственно [2, 8, 15]. В работах A. Voumvouraki et al [22] показано, что уровень ГК был повышен у всех пациентов с патологией печени, но наиболее высоких концентраций этот показатель достигал в группе с циррозом и гепатоцеллюлярной карциномой.

Неоднородность данных, полученных при исследовании и трактовке результатов концентрации ГК при патологии печени и определило цель настоящей работы — оценить уровень ГК и установить его диагностическую ценность и прогностическую значимость при хронических заболеваниях печени.

Исследование проводилось в несколько этапов в период с 2007 по 2015 год на базах Пермского краевого гепатологического центра, Пермской краевой клинической инфекционной больницы (инфекционное отделение № 2) и клинической медико-санитарной части № 1 Перми (гастроэнтерологическое отделение). Всего было обследовано 200 больных с хроническими заболеваниями печени: 170 больных ХГС (средний возраст 38,89±11,31 года) и 30 пациентов с ЦП в исходе гепатита С (54,5±11,7 года) в фазе субкомпенсации (класс В по Чайлд-Пью). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Контрольная группа состояла из 30 практически здоровых лиц, не имеющих в анамнезе заболеваний печени.

Вирусный гепатит С у пациентов обследованных групп диагностирован по результатам лабораторных исследований. Обнаружение РНК вируса гепатита С проводили методом ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени при использовании набора реагентов РеалБест ВГС ПЦР ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск на амплификаторе CFХ-96 Bio-RadLaboratories, Inc., США. Выявление и подтверждение наличия в образцах сыворотки крови специфических антител класса G и М (IgG и IgM) к антигенам вируса гепатита С проводили методом ИФА с помощью наборов реагентов «Бест анти-ВГС» (комплекты 2 и 4) и «РекомбиБест анти-ВГС-IgM» ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск на планшетном фотометре Stat-Fax-2100n Awareness Technology Inc., США.

Исследования уровня ГК в образцах сыворотки выполнены методом иммуноферментного анализа на анализаторе Stat-Fax-2100 (Awareness Technology Inc., США) с помощью набора ВСМ Diagnostics (США). Для забора венозной крови и получения сыворотки применяли пробирки Improvacuter с активатором свертывания. Для получения образцов цельной крови забор осуществляли в пробирки Improvacuter с антикоагулянтом ЭДТА.

В качестве референсного метода оценки плотности печени и стадии фиброза применялась ультразвуковая эластография печени (УЗЭ). Данное исследование проводилось с использованием аппарата Fibrockan-502 (Echosens C.A., Франция) по стандартной методике.

У всех пациентов ХГС с определенной длительностью инфекции и стадией фиброза по результатам УЗЭ печени была рассчитана скорость развития фиброза (СРФ) как соотношение фиброза (в баллах) к длительности инфицирования (в годах) [19]. Данный показатель является количественным отражением темпов прогрессирования хронического гепатита. Этот метод позволил выделить быстрый (>10 лет) и медленный (<10 лет) темпы прогрессирования фиброза при гепатите в ЦП.

Cтатистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программного обеспечения Statistica 7 (StatSoft). Полученные результаты оценивали методами описательной статистики с расчетом среднего арифметического (M), стандартного отклонения (SD), медианы (Me) и интерквантильного диапазона (25–75 процентов перцентиль). Различия считались достоверными при р<0,05. Приведенные коэффициенты корреляции рассчитывались по методу парной линейной корреляции Пирсона ^®.

Для расчета пороговых значений, диагностической эффективности и прогностической значимости уровня ГК были построены кумулятивные кривые и проведен ROC-анализ с расчетом отношения шансов (QR). Оценку графических моделей проводили по экспертной шкале значений площади под ROC-кривой (Аrea Under Сurve), данные которой отражены в таблице 1.

Таблица 1

Шкала оценки качества модели по значениям площади под ROC-кривой

Оценка адекватности прогноза проводилась по четырехпольной таблице с расчетом показателей чувствительности и специфичности, воспроизводимости и соответствия. Прогноз считался удовлетворительным при чувствительности ≥80 процентов, специфичности ≥75 процентов, воспроизводимости ≥50 процентов и соответствии ≥75 процентов [1].

Диагностическая значимость уровня гиалуроновой кислоты для дифференциации хронического гепатита и цирроза печени

На первом этапе в период с 2007 по 2008 год нами была проанализирована эффективность стратификации гепатита и цирроза печени среди обследованных 50 больных с ХГС и 30 пациентов с ЦП в исходе вирусного гепатита С с помощью значений уровня ГК. Проведены определение и оценка диагностической чувствительности, диагностической специфичности уровня ГК, построены кумулятивные кривые и найдены точки разделения для значений данного показателя при разных патологиях.

При обследовании пациентов с ХЗП концентрация ГК в сыворотке крови была достоверно выше при ХГС (р = 0,02) и особенно при ЦП (р=0,007) в сравнении с группой контроля, между группами пациентов также были достоверные различия (р=0,00001) (табл. 2).

Значения ГКСкрытьТаблица 2

Концентрация гиалуроновой кислоты (нг/мл) в сыворотке крови больных ХГС, ЦП и в группе контроля, М±SD

Примечание: 1 различия достоверны в группе ХГС в сравнении с контролем;

2 различия достоверны в группе ЦП в сравнении с контролем;

3 различия достоверны в группе ЦП в сравнении с ХГС.

Для ГК точка разделения (максимальное расхождение кумулятивных кривых) составила 100 нг/мл (рис. 1). У всех больных при ЦП уровень ГК был выше 100 нг/мл. Таким образом, диагностическая чувствительность теста, то есть способность теста исключать ЦП при концентрации ниже 100 нг/мл, составляет 100 процентов.

Рис. 1. Кумулятивные кривые концентрации гиалуроновой кислоты при хроническом гепатите и циррозе печени (ось ординат — процент обследованных, ТР — точка разделения)

У 20 процентов больных ХГС концентрация ГК была выше 100 нг/мл, что обеспечивает специфичность теста для диагностики ЦП в 80 процентов. Это может быть связано с наличием системного воспалительного ответа при ХГС у ряда больных. Интегративный показатель диагностической эффективности ГК для стратификации ХГ и ЦП достигает 87,5 процента. Согласно проведенным исследованиям, ЦП у пациентов с ХГС исключается при концентрации ГК <100 нг/мл.

Второй этап исследования проводился в период с 2013 по 2015 год. В качестве референсного метода оценки стадии ФП у больных ХГС была использована УЗЭ печени.

По результатам данного исследования в соответствии с пороговыми значениями пациенты были разделены на подгруппы в зависимости от стадии фиброза. В среднем в группе больных ХГС (n=150), по данным УЗЭ, плотность печени составила 6,8 (5,5; 8,9) кПа.

Значения плотности печеночной ткани достоверно увеличивались в зависимости от стадии фиброза. Плотность печени у мужчин, по данным УЗЭ, составляла 7,8 (6,5; 10,15) кПа и была значимо больше, чем у женщин — 6,75 (5,5; 8,7) кПа (р=0,03), что указывает на более выраженные признаки ФП у мужчин в настоящем исследовании.

При исследовании уровня прямого лабораторного маркера фиброза печени — ГК в сыворотке крови обнаружены достоверно более высокие значения у больных ХГ в сравнении с группой здоровых лиц 35,4 (19,3; 61,1) и 21,0 (8,0; 30,1) нг/мл соответственно при р=0,01). Средняя концентрация ГК у больных с умеренным фиброзом (F1-2) в два раза превышала уровень этого показателя в группе при отсутствии ФП (F0) (р=0,001), в два раза была выше при тяжелом фиброзе (F3) в сравнении с умеренным фиброзом (р=0,001), а также позволяла дифференцировать стадии F3 и F4 (р=0,01) (табл. 3).

Таблица 3

Значения ультразвуковой эластографии и гиалуроновой кислоты в зависимости от стадии фиброза при ХГ, Ме (25; 75)

Примечание: * различия достоверны во всех группах сравнения.

Диагностическая значимость уровня гиалуроновой кислоты для оценки стадии фиброза печени

В рамках данного исследования была установлена корреляционная связь плотности печеночной ткани по данным УЗЭ с концентрацией в крови ГК — лабораторный прямой маркер фиброза (r=0,79).

Оценка лабораторных характеристик данного показателя определения стадии ФП на модели больных ХГС (n=120) проводилась по четырехпольной таблице с расчетом показателей чувствительности и специфичности, а также показателей воспроизводимости и соответствия. Диагностические характеристики теста определения уровня ГК в крови для оценки стадии ФП при ХГС представлены в таблице 4.

Характеристика ГКСкрытьТаблица 4

Диагностические характеристики гиалуроновой кислоты для оценки стадии фиброза печени

Для оценки предсказательной ценности ГК и выбора пороговых значений был построен график ROC-кривой (рис. 2). Площадь ROC-кривой для ГК как предиктора ФП составила AUC 0,94±0,03 (доверительный интервал 0,86–0,98), р<0,001.

Рис. 2. ROC-кривая гиалуроновой кислоты для оценки стадии ФП

Индекс Юдена для данного показателя составил 0,85. Оптимальное пороговое значение ГК для исключения ФП составило 42 нг/мл при чувствительности — 91,9 процента и специфичности — 93,2 процента. Пороговые значения ГК для диагностики стадий ФП при ХГС представлены в таблице 5.

Таблица 5

Пороговые значения гиалуроновой кислоты для диагностики стадий фиброза печени

Таким образом, в обследованной группе пациентов при отсутствии фиброза печени (F0) концентрация ГК ≤42 нг/мл. Стадии умеренного фиброза (F1-2) соответствует уровень 70,3 нг/мл ≥ ГК > 42 нг/мл, стадии тяжелого фиброза (F3) — уровень 104,3 нг/мл ≥ ГК > 70,3 нг/мл, ЦП в исходе ХГС диагностируется при уровне ГК >104,3 нг/мл. Эти данные подтверждают результаты, полученные нами на первом этапе исследования, согласно которым ЦП диагностируется при уровне ГК более 100 нг/мл и соответственно исключается у больных ХГ при концентрации этого маркера ниже 100 нг/мл.

Прогнозирование темпа прогрессирования фиброза печени на модели больных хроническим гепатитом С

У всех пациентов с определенной длительностью инфекции и стадией заболевания (выраженность фиброза в печени) по результатам УЗЭ печени была рассчитана СРФ, которая в среднем составила 0,19±0,18 балла/год (от 0 до 2 баллов/год). Следует отметить, что у больных ХГС с начальным фиброзом (F1) средняя СРФ была достоверно ниже (0,21±0,13 балла/год), чем у пациентов с последующими стадиями заболевания: F2 — 0,44±0,31 балла/год (р=0,01), FЗ — 0,53±0,4 балла/год (р=0,01), F4 — 0,51±0,03 балла/год (р=0,69). В группе больных с высокой СРФ ожидаемо регистрировались достоверно большие значения плотности печени по данным УЗЭ (р<0,001). Уровень ГК при быстром темпе прогрессии заболевания был выше в 2,3 раза (52,3 (34; 78,6) нг/мл), чем при медленной СРФ — 22,3 (17; 30,9) нг/мл (р<0,001).

В рамках данного исследования установлена значимая корреляционная связь темпа прогрессии фиброза с уровнем ГК (r=0,6; р<0,001), который в данном исследовании считали предиктором прогрессирования ФП у пациентов с ХГС (n=81). Оценку предсказательной ценности данного маркера в отношении темпа прогрессирования ФП и выбор его порогового значения проводили с помощью ROC-кривых. Пациентов исследуемой выборки разделили на две группы: в соответствии с медленной (n=46) и высокой СРФ (n=35). Предсказательную ценность каждого параметра оценивали по значениям площади под ROC-кривой (AUC). Площадь ROC-кривой для ГК как предиктора прогрессирования фиброза составила 0,95±0,02 (доверительный интервал 0,88–0,98), р<0,001 (рис. 3).

Рис. 3. ROC-кривая для гиалуроновой кислоты как предиктора прогрессирования фиброза

Индекс Юдена для данного показателя составил 0,84. Оптимальное пороговое значение ГК для дифференциации темпа прогрессирования ФП равнялось 40,4 нг/мл при чувствительности 97,1 процента и специфичности 87 процентов.

Таким образом, в обследуемой группе пациентов медленный темп прогрессии ФП при ХГС диагностируется при концентрации ГК в крови ≤40,4 нг/мл, высокий — при концентрации ГК в крови >40,4 нг/мл.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что использование неинвазивного лабораторного прямого маркера фиброза ГК при ХЗП позволяет стратифицировать стадии ФП, прогнозировать темп его прогрессирования при ХГС и диагностировать переход в ЦП с высокой диагностической эффективностью.

Список использованной литературы

1. Власов В. В. Эффективность диагностических исследований. М.: Медицина, 1988. 256 с.

2. Гусев Д. А. Хронический гепатит С: течение, прогноз и лечение больных в военно-медицинских учреждениях: Автореф. дис. … д. м. н. М., 2006. 47 с.

3. Ивашкин В.Т., Павлов Ч. С. Фиброз печени. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. 168 с.

4. Мехтиев С.Н., Степаненко В.В., Зиновьева Е.Н., Мехтиева О. А. Современные представления о фиброзе печени и методах его коррекции // Фарматека. 2014. № 6. С. 80–87.

5. Павлов Ч.С., Золоторевский В.Б., Томкевич М. С. Возможность обратимости цирроза печени (клинические и патогенетические предпосылки) // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2006. № 6. С. 20–29.

6. Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Ивашкин В. Т. Современные возможности эластометрии, фибро- и акти-теста в диагностике фиброза печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2008. № 4. C. 43–52.

7. Пинцани М. Эволюция фиброза печени: от гепатита к циррозу // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2002. № 5. С. 4–10.

8. Сафиуллина Н. Х. Диагностическая роль коллагена IV типа и гиалуроновой кислоты в оценке степени воспаления и стадии фиброза печени у больных хроническим гепатитом С: Дис. … к. м. н. М., 2004. 140 с.

9. Шептулина А.Ф., Широкова Е.Н., Ивашкин В. Т. Неинвазивная диагностика фиброза печени: роль сывороточных маркеров // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2015. № 2. С. 28–40.

10. Щекотов В.В., Щекотова А.П., Булатова И.А., Мугатаров И. Н. Способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и цирроза печени: патент 2383021, РФ / Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели». 2010. № 6. С. 4.

11. Berzigottia A., Ashkenazia Е., Revertera Е. Non-invasive diagnostic and prognostic evaluation of liver cirrhosis and portal hypertension // Dis. Markers. 2011. Vol. 31. № 3. P. 129–138.

12. Boursier J. et al. An extension of STARD statements for reporting diagnostic accuracy studies on liver fibrosis tests: The Liver-FibroSTARD standarts // J. Hepatol. 2015. Vol. 62. № 4. P. 807–815.

13. Ellis E.L., Mann D. A. Clinical evidence for the regression of liver fibrosis // J. Hepatol. 2012. Vol. 56. № 5. P. 1171–1180.

14. Friedman S. L. Liver fibrosis in 2012: Convergent pathways that cause hepatic fibrosis in NASH // Nat Rev. Gastroenterol Hepatol. 2013. Vol. 10. № 2. P. 71–72. .

15. Halfon P., Bourliere М., Penaranda G. et al. Accuracy of hyaluronic acid level for predicting liver fibrosis stages in patients with hepatitis C virus // Comp. Hepatol. 2005. Vol. 4. P. 6–13.

16. Leeming D.J. et al. Novel serological neo-epitope markers of extracellular matrix proteins for the detection of portal hypertension // Aliment. Pharmacol. Ther. 2013. Vol. 38. № 9. P. 1086–1096.

17. Liu T., Wang Х., Karsdal M.A. et al. Molecular serum markers of liver fibrosis / Biomark. Insights. // 2012. Vol. 7. P. 105–117.

18. Povero D. Busletta С., Novo Е. et al. Liver fibrosis: a dynamic and potentially reversible process // Histol. Histopathol. 2010. Vol. 25. № 8. P. 1075–1091.

19. Poynard T., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C // Lancet. 1997. Vol. 349. № 9055. P. 825–832.

20. Poynard T., Ngo Y., Munteanu М. et al. Noninvasive markers of hepatic fibrosis in chronic hepatitis B // Curr. Hepat. Rep. 2011. Vol. 10. № 2. P. 87–97.

21. Saitou Y., Shiraki К., Yamanaka Y. Noninvasive estimation of liver fibrosis and response to interferon therapy by a serum fibrogenesis marker, YKL-40, in patients with HCV-associated liver disease // World J. Gastroenterol. 2005. Vol. 28. № 11. P. 476–481.

22. Voumvouraki A. et al. Serum surrogate markers of liver fibrosis in primary biliary cirrhosis // Eur. J. Intern. Med. 2011. Vol. 22. P. 77–83.

23. Wynn А. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis // J. Pathology. 2008. Vol. 214. № 2. P. 199–210.